J. Am. Chem. Soc.:從組合生物雜交核酸堿基肽庫中發現核酸結合分子

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引言



核酸(RNADNA)靶向治療受到了研究者們的廣泛關注,其靶向途徑涵蓋了從小分子到大于100 kDa的復合大分子(CRISPR-Cas)范圍的所有分子。核酸作為治療目標,主要原因在于特定基因的突變、轉錄活性的失調和非編碼RNAncRNA)是許多遺傳和獲得性病理學的核心。即像肽又像核酸的合成非生物聚合物是靶向核酸的一種有趣形式。這些聚合物應具有對特定寡核苷酸的高親和力和選擇性。由于氨基酸側鏈允許其具有高度多樣化的結構和功能,而核酸堿基可以通過堿基配對與核酸相互作用,因此多年來科學家希望生產出二合一的生物材料。盡管科學家在這類二合一生物材料方面做出許多努力,到目前為止還沒有針對混合肽生物雜交的可靠高通量選擇/解碼策略的報道。




成果簡介



近日,麻省理工學院的Bradley L. Pentelute在《J. Am. Chem. Soc .》期刊上發表了題為“Discovery of Nucleic Acid Binding Molecules from Combinatorial Biohybrid Nucleobase Peptide Libraries”的研究論文。在該研究中,作者描述了生物雜交核堿基肽的有效合成和從頭測序程序的發展,通過將蛋白質氨基酸和核堿基與單一低分子量精密聚酰胺聚合物結合在一起,建立了有效的化學合成和從頭測序程序,并準備了具有多達1億個生物雜交分子的組合文庫。與僅由規范氨基酸組成的肽相比,這種生物雜交材料對寡核苷酸的堆積親和力更高。使用親和力選擇質譜,作者發現了與前體microRNA發夾具有高度親和力的變體。該平臺為高通量篩選靶向特定寡核苷酸鏈聚合物提供了有前途的途徑。





圖文解讀



1、生物雜合序列聚合物的最新實例。(A)在David Liu實驗室開發的高度功能化的核酸。這些結構可以通過PCR擴增并測序,因此可用于適體選擇。BHeemstra課題組開發的改良PNA。通過疏水性和親水性側鏈驅動PNA自組裝成超分子結構,保留對RNA的序列特異性結合。(C)本文工作:開發了用于核酸堿基肽的有效合成和測序策略,從而可以從組合文庫中開展篩選實驗。


方案1、(A)合成十二種核酸堿基氨基酸單體。(B)通過Fmoc固相肽合成(SPPS)將核酸堿基氨基酸單體摻入肽中。由于聚酰胺具有化學穩定性,可通過SPPS高效組裝。且Fmoc保護的氨基酸是可商購的,并且已有文獻中已經報道了幾種與SPPS相容的展示堿基的氨基酸單體。因此選擇具有基于α-氨基酸的單體的聚酰胺肽主鏈來合成生物雜交核堿基肽文庫。首先重點研究基于α-氨基酸的結構單元。這些單體可使序列特異性的聚合物具有識別二級結構的潛力,并適合采用針對典型肽段和蛋白質組學優化的MS / MS方法和算法進行從頭測序。首先合成了十二個核堿基氨基酸單體。為了在覆蓋廣闊的化學空間的同時確定合成的可及性和測序兼容性,制備了具有不同接頭的三個單體組,這些接頭將四個核堿基中的每一個與氨基酸部分相連(1A)。通過與各自的核堿基的親核開環將絲氨酸內酯轉化為丙氨酰核堿基單體,核堿基與丙氨酰支架之間的連接基為亞甲基。通過用相應的核堿基對溴進行親核取代,將溴高丙氨酸轉化為高丙氨;hAla)核堿基單體。將二氨基丁酸Dab)與核堿基乙酸衍生物偶聯,提供帶有乙基酰胺基甲基接頭的Dab-核堿基單體。隨后將12個核堿基單體有效地摻入具有氨基酸結構單元的短肽中(1B),通過LC-MS測定,這12種粗核堿基肽的純度為70%至99%。


2、使用串聯MS / MS和測序軟件,從頭確定了每個化合物具有多達四個核堿基的核堿基肽的從頭序列。(A)分別合成三個核堿基單體(藍色:丙氨;;紫色:高丙氨;;綠色:Dab)和規范氨基酸殘基的三個組合文庫,并通過納米 LC-MS / MS分析。使用軟件PEAKS 8.5進行從頭測序,并篩選最終列表以尋找正確文庫設計的序列。右側柱狀圖為鑒定的總序列和含有不同數量核堿基的序列的百分比。使用非天然聚合物進行篩選實驗需要高保真從頭測序。通過專注于擁有約200個成員的組合文庫建立了從頭測序程序。首先在三個不同的文庫中分析了丙氨;,高丙氨;Dab核堿基單體,以確定每個接頭對測序的影響。文庫設計12345678K,其中1、3、68是兩個規范氨基酸之一,而2、4、57是規范氨基酸或四個核堿基單體之一。每個文庫的總多樣性為28 =256。每個文庫包含具有一個核堿基的64個序列,具有兩個核堿基的96個序列,具有三個核堿基的64個序列和具有四個核堿基的16個序列。實驗表明> 70%的核堿基肽均可通過從頭MS / MS測序進行序列鑒定。(B)三個文庫中核酸堿基的MS/MS譜圖,右側顯示了堿基側鏈的片段。顯示肽主鏈片段化以及核堿基和核堿基-乙;Dab文庫)解離。在丙氨酰文庫中觀察到最突出的核堿基解離,可能解釋了其較低的序列識別率。


3、具有多達1億個生物雜交分子的組合文庫。(A)分別表示單體集和生物雜交核堿基肽或規范肽的1億個成員文庫的示意圖。(B)根據所使用單體的百分比計算文庫中每個序列的堿基數。測序實驗的結果表明,所有三組核苷堿基單體均可用于文庫合成和測序。隨后準備了一個組合庫,格式為X9K,每個可變位置使用12個核堿基單體和18個規范氨基酸。將固定的Lys殘基置于C端,以促進MS / MS測序,所有y型離子上均帶恒定電荷。單珠化合物(OBOC)拆分和合并合成用于制備具有約108個成員的文庫(3A),該大小適合基于磁珠的親和力選擇。該文庫的大小是高多樣性(增加識別結合物的可能性)與每個文庫成員的足夠濃度以確保用于親和力選擇和后續MS / MS測序的材料(每個化合物約10 fmol)的足夠濃度之間的折衷。為了控制每個序列的核堿基數量,對分池合并過程進行了偏置:在每個偶聯步驟中,將20%的樹脂用于12個核堿基肽,而80%的樹脂用于規范殘基;诖,文庫分布表明86%的序列將具有1-4個核堿基(顯示了高可信度測序),11%的無核堿基和3%的5個或更多核堿基(3B)。


4、雜合核堿基肽相較于標準肽對寡核苷酸具有更高的親和力。(AELISA測定法示意圖:將固定的核堿基肽庫或規范肽庫分別與生物素化的DNA庫一起孵育。(BELISA結果圖:核堿基肽對DNA的親和力高于規范肽。將具有相同格式(X9K,1億成員)的核堿基肽庫和規范肽庫固定在ELISA(酶聯免疫吸附測定)板上,并與生物素化DNA庫(Biotin-N20,N:腺嘌呤,胞嘧啶,胍或胸苷)。另外,固定帶正電的肽38LKKLLKLLKKWLKLKLK),以探測靜電相互作用。暴露于與鏈霉親和素(SA)和四甲基聯苯胺(TMB)偶聯的辣根過氧化物酶(HRP)后締合。與規范肽庫和帶正電的肽相比,核堿基肽庫顯示出明顯更高的信號,表明核堿基肽文庫是鑒定核酸結合物的優選庫。


5、通過親和力選擇鑒定對RNA發夾具有納摩爾親和力的核堿基肽。(A)基于磁珠的親和力選擇的示意圖(紅色:鏈霉親和素包被的磁珠;棕色:生物素化的前miRNA)。(B)通過親和力選擇鑒定序列的ETD譜。(C)選定序列的結構。(D)用于將前體質量提取的離子計數;E)前體miRNA-21與固定化的39-生物素的BLI結合/解離。(F)前體miRNA-155與固定的39-生物素的BLI結合/解離。(G39和與RNADNA寡核苷酸結合的衍生物的匯總表。由于細胞中的基因表達受miRNA控制,而miRNA與疾病相關,因此前miRNA發夾的靶向備受關注。與結構化發夾前體miRNA的結合可能會抑制加工成成熟的活性miRNA。本文選擇與疾病有關的兩個前體miRNA是前體miRNA-21和前體miRNA-155。設想核堿基肽庫可用于發現高親和力的前體miRNA-發夾結合物。將生物素化的前體miRNA21155)固定在抗生蛋白鏈菌素磁珠上,并與1億成員核堿基肽文庫(5A)孵育。用測序軟件PEAKS 8.5可視化所得的MS光譜,并使用Python腳本進一步完善,該腳本指定了與庫設計匹配的變體。最后,為每個變體創建提取的離子色譜圖(基于PEAKS用于測序的前體離子):僅將在色譜圖中產生清晰峰的化合物視為選定5D)。在對照色譜圖中對相同離子進行交叉分析(僅對珠子進行分析)可以排除潛在的非特異性珠子或鏈霉親和素結合劑。在這些步驟之后,為了富集前體miRNA21,僅鑒定了一種核堿基肽:Lys-DabG-hAlaA-Arg-Asp-DabA-Leu-hAlaG-Ala-Lys5B,C)。在前體miRNA-155富集的LCMS色譜圖中鑒定出了變異離子,在未修飾的對照樣品中不存在(5D)。為了驗證選定序列與前體miRNA發夾的結合,合成了具有C端生物素手柄(39-生物素)的化合物。將39生物素固定在生物層干涉術(BLI)鏈霉親和素尖端上,并確定溶液中前體miRNA21在不同濃度下的締合/解離:發現前體miRNA21的解離常數(Kd)為9 nM4E)和前體miRNA-15512 nM4F)。而對缺少發夾環的前體miRNA-21莖的親和力降低了50倍以上,表明發夾環對于結合39的重要性。且選定的核堿基肽與RNA發夾的結合比DNA發夾,單鏈DNAssDNA)和雙鏈DNAdsDNA)更具選擇性。為了研究核堿基單體和單個殘基在選定序列中的作用,合成了幾種類似物。首先,將4個核堿基單體突變為丙氨酸,色氨酸或谷氨酰胺。這些變體顯示出對前體miRNA21的結合親和力降低(> 50-100倍降低;5G)。接下來,通過對每個位置進行丙氨酸掃描,發現N端賴氨酸和4位精氨酸的突變消除了結合,而對所有其他位置的單突變耐受,并且不會顯著影響其與前體miR21的結合(5G)。



總結與展望


非生物合成聚合物是功能性材料或治療藥物開發的新形式。在這項工作中,作者展示了SPPS對核堿基單體的設計和合成。強大的合成程序可以制備數百萬個組合文庫,并且與標準肽相比,這類材料對核酸的親和力增強。本文構建的平臺顯示了高通量發現序列特異性合成非生物聚合物的可能性,這些聚合物具有有利于寡核苷酸結合的特性。作者還建立了生物雜交核堿基肽聚合物的合成和測序程序,每個序列最多包含十個殘基和四個核堿基。綜上所述,本研究突出了合成組合文庫與現代質譜相結合的潛力,可用于探索新的化學空間和發現配體。作者設想通過繼續進入化學空間領域將為發現具有新穎功能,特性甚至酶活性的材料創造機會。



文獻鏈接


DOI: 10.1021/jacs.0c08964

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.0c08964



作者簡介


Bradley L. Pentelute,麻省理工學院教授。

研究興趣:主要目標是發明新的化學方法來修飾自然界中的蛋白質,從而增強其對人類醫學的治療性能;還致力于將大生物分子傳遞到細胞質中。

作者主頁:http://pentelutelabmit.com/



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